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RIPA Buffer (10X)

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1. 如果繼續使用緩沖液,則建議將 10X 緩沖液保存在 4°C 下 1-2 周。如要保存更長時間,則緩沖液應保存在 -20°C 下。如果要進行數次實驗,則建議分裝 10X 緩沖液。

2. 在 24-30°C 下解凍 10x 緩沖液,上下顛倒混合。

3. 用 ddH2O 將 10X RIPA Buffer 稀釋為 1X 溶液。該產品提供的 10X 材料足以制備 150ml 總細胞提取物。

4. 將 1X 緩沖液放在冰上冷凍,并在使用前立即添加 PMSF。

注意:CST 建議使用前立即添加 1 mM PMSF。

裂解:

如需裂解黏附細胞,我們建議以下步驟:(所有試劑和裂解物必須冷藏)。

1. 按需處理細胞。

2. 平板用 PBS 洗滌,以去除殘留的培養基。

3. 每個 10 cm 的培養皿添加 400 μl 1x RIPA 緩沖液。

4. 平板放在冰上孵育 5 分鐘。

5. 刮取細胞。

6. 超聲短暫處理。

7. 提取物用冷微量離心機以 14,000 x g 的離心力離心分離 10 分鐘。

8. 取上清液后使用。

其他注意事項:

1. 對于非黏附細胞,用 1X PBS 洗滌并進行沉淀后,每 107 個細胞添加 400 μl 緩沖液。

2. 1X RIPA Buffer 可用于裂解組織樣品,盡管在添加裂解緩沖液后建議進入均化步驟。按照 100 mg 組織對應 1 ml 緩沖液的比例提取組織。組織提取物還需進行超聲處理。

3. 其他蛋白酶抑制劑可添加到 1x 裂解緩沖液中。

4. 試劑抵達時,該緩沖液中可能會發生聚沉,因為提供的 10X 配制液中包含高濃度的試劑。有時,即便加熱到室溫,也會持續聚沉。我們建議將緩沖液加熱到 37°C 15 分鐘后混合,以消除沉淀?;蛴?ddH2O 將 10X RIPA 稀釋為至少 5X 的溶液,以便獲得不含沉淀物的溶液。一旦稀釋,可進行分裝并保存在 -20°C 下供日后使用。

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